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培养基
培养基
 
培养基
培养基(Medium)是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。
 
按所用原料不同,可分为两类:应用肉汤、马铃薯汁等天然成分配制的,称为天然培养基;应用化学药品配成并标明成分的,称为合成培养基或综合培养基。化学试剂中的培养基,大多为合成培养基。由于液体培养基不易长期保管,现在均改制成粉末。培养基由于配制的原料不同,使用要求不同,而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后,易被细*污染或分解变质,因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基(如组织培养基),较长时间的贮存,必须放在2~6。C的冰箱内。
 
常见培养基有:
 
1、细*培养基 
 
配方一 牛肉膏琼脂培养基 
 
牛肉膏0.3克 ,蛋白胨1.0克,氯化钠 0.5克,琼脂 1.5克, 
 
水 100毫升 
 
在烧杯内加水100毫升,放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠,用蜡笔在烧杯外作上记号后,放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后,加入琼脂,不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水,用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2~7.6,分装在各个试管里,加棉花塞,用高压蒸汽灭菌30分钟。 
 
配方二 马铃薯培养基 
 
取新鲜牛心(除去脂肪和血管)250克,用刀细细剁成肉末后,加入500毫升蒸馏水和5克蛋白胨。在烧杯上做好记号,煮沸,转用文火炖2小时。过滤,滤出的肉末干燥处理,滤液pH值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心,灭菌,备用。 
 
配方三 根瘤菌培养基 
 
葡萄糖 10克 磷酸氢二钾 0.5克 
 
碳酸钙 3克 硫酸镁 0.2克 
 
酵母粉 0.4克 琼脂 20克 
 
水 1000毫升 1%结晶紫溶液 1毫升 
 
先把琼脂加水煮沸溶解,然后分别加入其他组分,搅拌使溶解后,分装,灭菌,备用。 
 
2、放线菌培养基 
 
配方一 淀粉琼脂培养基(高氏培养基) 
 
可溶性淀粉 2克 硝酸钾 0.1克 
 
磷酸氢二钾 0.05克 氯化钠 0.05克 
 
硫酸镁 0.05克 硫酸亚铁 0.001克 
 
琼脂 2克 水 100毫升 
 
先把淀粉放在烧杯里,用5毫升水调成糊状后,倒入95毫升水,搅匀后加入其他药品,使它溶解。在烧杯外做好记号,加热到煮沸时加入琼脂,不停搅拌,待琼脂完全溶解后,补足失水。调整pH值到7.2~7.4,分装后灭菌,备用。 
 
配方二 面粉琼脂培养基 
 
面粉 60克 琼脂 20克 
 
水 1000毫升 
 
把面粉用水调成糊状,加水到500毫升,放在文火上煮30分钟。另取500毫升水,放入琼脂,加热煮沸到溶解后,把两液调匀,补充水分,调整pH值到7.4,分装,灭菌,备用。 
 
3、真*培养基 
 
配方一 萨市(Sabouraud’s)培养基 
 
蛋白胨 10克 琼脂 20克 
 
麦芽糖 40克 水 1000毫升 
 
先把蛋白胨、琼脂加水后,加热,不断搅拌,待琼脂溶解后,加入40克麦芽糖(或葡萄糖),搅拌,使它溶解,然后分装,灭菌,备用。 
 
本培养菌是培养许多种类真*所常用的。 
 
配方二 马铃薯糖琼脂培养基 
 
把马铃薯洗净去皮,取200克切成小块,加水1000毫升,煮沸半小时后,补足水分。在滤液中加入10克琼脂,煮沸溶解后加糖20克(用于培养霉菌的加入蔗糖,用于培养酵母菌的加入葡萄糖),补足水分,分装,灭菌,备用。 
 
把这培养基的pH值调到7.2~7.4,配方中的糖,如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌。 
 
配方三 黄豆芽汁培养基 
 
黄豆芽 100克 琼脂 15克 
 
葡萄糖 20克 水 1000毫升 
 
洗净黄豆芽,加水煮沸30分钟。用纱布过滤,滤液中加入琼脂,加热溶解后放入糖,搅拌使它溶解,补足水分到1000毫升,分装,灭菌,备用。 
 
把这培养基的pH值调到7.2~7.4,可用来培养细*和放线菌。 
 
配方四 豌豆琼脂培养基 
 
豌豆 80粒 琼脂 5克 
 
水 200毫升 
 
取80粒干豌豆加水,煮沸1小时,用纱布过滤后,在滤液中加入琼脂,煮沸到溶解,分装,灭菌,备用。 
 
4、食用菌菌种培养基 
 
配方一 马铃薯—蔗糖--琼脂培养基 
 
20%马铃薯煮汁 1000毫升 
 
蔗糖 20克 琼脂 18克 
 
把马铃薯洗净去皮后,切成小块。称取马铃薯小块200克,加水1000毫升,煮沸20分钟后,过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升,即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖,煮沸,使它溶解后,补足水分,分装,灭菌,备用。使用该培养基对pH值要求不严格,可以不测定。 
 
配方二 综合马铃薯培养基 
 
20%马铃薯煮汁 1000 毫升
 
磷酸二氢钾 3克 硫酸镁 1.5克 
 
葡萄糖 20克 维生素 10毫克 
 
琼脂 18克 
 
先配制20%马铃薯煮汁,方法同上。在煮汁中加入上述各种组分,加热溶解后补足水分,调整pH值到6。分装,灭菌,备用。 该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。 
 
5.烟草的培养基
 
在植物组织培养时,通过调节IAA和CTK的比值能影响愈伤组织分化出根或芽.CTK/IAA高时,愈伤组织分化芽
 
CTK/IAA低时,分化根;CTK/IAA比例适中维持愈伤组织不分化 
 
愈伤组织诱导培养基制备 
 
以MS培养基母液为基础,向洁净铝锅中顺序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL ,维生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配制得MS培养基后,再加入0.5mg·L-1的BA8mL,0.5mg·L-1的NAA8mL.然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入40g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl调整pH值*5.8-6.0.加入14g琼脂,将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容*终体积2L,继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中. 
 
烟草叶片愈伤组织诱导 
 
取一无菌培养皿,用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用解 
 
剖刀将叶片切成2mm2左右的小片,然后将其接种于准备好的培养基上,每瓶接种 
 
5小片,一共接种6瓶.接种后的三角平置于24条件下黑暗培养1周,然后在同 
 
样温度下有光照和全黑暗下培养3周直*愈伤组织形成(两种情况各置3瓶).观 
 
察愈伤组织诱导结果,统计愈伤组织诱导率. 
 
器官分化及植株再生培养 
 
将诱导的愈伤组织按类型分别转入分化培养基上,置于连续光照,温度20-22 C条件下培养3周,统计愈伤组织再生植株情况. 
 
愈伤组织诱导的总体情况 
 
烟草愈伤组织诱导培养4周后,愈伤组织基本形成,即排除因生长时间不够而 
 
未形成愈伤的情况.具体情况见表一中所示,6瓶培养物均有愈伤形成,且都未发 
 
生污染,但诱导率几乎各不相同.其中, 在光照条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为 
 
60.0℅, 在黑暗条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为46.7%.由于实验过程中,外植 
 
体即烟草叶片取得偏小,接种时可能已有部分外植体的大部分细胞脱水死亡,使整 
 
个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小. 
 
培养基还有:1640培养基
 
特殊培养基:
 
一 选择性培养基 
 
1酵母菌富集培养基 
 
葡萄糖5% 尿素0.1% 硫化铵0.1% 磷酸二氢钾0.25% 磷酸氢二钠0.05% 七水合硫酸镁0.1% 七水合硫酸铁0.01% 酵母膏0.05% 
 
孟加拉红0.003% pH4.5 
 
2 Ashby无氮培养基 富集好养自生固氮菌 
 
甘露醇1% 磷酸二氢钾0.02% 七水合硫酸镁0.02% 氯化钠0.02% 
 
二水合硫酸钙0.01% 碳酸钙0.5% 
 
二 鉴别培养基 
 
EMB培养基,常用于鉴别E.coli 
 
蛋白胨 10g 乳糖5g 蔗糖5g 磷酸氢二钾2g 伊红Y 0.4g 美蓝0.065g 
 
蒸馏水1000g pH7.2 
 
分离海洋微生物的培养基配方 
 
2216E培养基配方(固体培养基) 
 
蛋白胨 5克 
 
酵母膏 1克 
 
磷酸高铁 0.01克 
 
琼脂 15-----20克 
 
陈海水 1000毫升 
 
煮沸氢氧化纳(5%)的溶液调PH值7.6—7.8 
 
其他培养基:
 
1.高氏一号培养基
 
KNO3:1g, 
 
NaCl:0.5g,
 
K2HPO4:0.5g
 
MgSO4·7H2O:0.5g
 
FeSO4·7H2O:0.01g
 
可溶性淀粉20g
 
琼脂20g
 
蒸馏水1000ml
 
pH调*7.2~7.4,121°C灭菌30min
 
制法:先用少量水将淀粉调成糊状,再取700ml水在电炉上加热煮沸
 
然后边搅拌便将淀粉糊倒入,同时保持沸腾。然后再将其他成分加入,
 
溶解后补足水分*1000ml
 
肉汤蛋白胨斜面:
 
蛋白胨10g
 
牛肉膏5g
 
蒸馏水1000ml
 
NaCl:5g
 
pH:7.0~7.2,121℃灭菌20min
 
如配制固体培养基需加琼脂1.5%~2%,半固体培养基可加琼脂0.5%~0.8%
 
不同的细胞培养基
 
天然细胞培养基
 
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴*、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
 
血清种类
 
目前用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因:来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。 
 
牛血清是细胞培养中用量*大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然,胎牛血清是品质*高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分*少。 
 
血清的主要成分
 
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激*、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。
 
血清主要作用
 
1. 提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。
 
2. 提供激*和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激*(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激*(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
 
3. 提供结合蛋白:结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激*等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 
 
4. 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 
 
5. 对培养中的细胞起到某些保护作用:有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,硒等。 
 
血清培养基主要问题
 
1. 血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激*和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难。 
 
2. 血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期*多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制。
 
3. 对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清,因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态,血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。 
 
4. 血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶,能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细*毒素等都会影响细胞生长,甚*造成细胞死亡。 
 
5. 动物个体不同,血清产地、批号不同,每批质量差异甚大,其成分不能保持一致。 
 
6. 取材中可能带入支原体、病毒,对细胞产生潜在影响,可能导致实验失败或实验结果不可靠性。 
 
7. 大规模生产中,血清来源越来越困难,价格昂贵,是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之*。 
 
血清的质量标准
 
血清质量高低取决于两方面因素:一是取材对象,二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内,取材过程应严格按照操作规程执行,制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求:
 
1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。
 
2. 有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。
 
3. 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。 
 
4. 血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌。 
 
5. 无细*、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无细*噬菌体污染。 
 
6. 对细胞有良好的支持繁殖作用。 
 
我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量,细*、真*、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细*内毒素,支持细胞增*检查。

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